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On peut filmer les cellules en 3D grâce à un nouveau microscope

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La microscopie ne cesse d'évoluer. Aujourd'hui, il est désormais possible d'observer l'intérieur des cellules en temps réel et... en 3D ! On n'attend plus que le son...

L'obtention d'une image à chaque plan focal permet de reconstruire l'objet en 3D. © Thomas A. Planchon et al., Nature Methods

Observer les mouvements internes des cellules serait un gros avantage pour les biologistes qui pourraient suivre en temps réel les processus cellulaires. Mais les microscopes semblaient avoir atteint leurs limites. Les microscopes électroniques, qui peuvent atteindre une résolution de quelques nanomètres, ne s'utilisent que sur des tissus fixés. Quant aux microscopes optiques, qui permettent de garder les échantillons vivants, ils sont bridés à une résolution de 200 nanomètres, le seuil de diffraction de la lumière.

Depuis quelques années, des solutions sont nées des cerveaux des scientifiques. Les techniques de PALM ont réussi à défier les limites de diffraction de la lumière et parviennent à atteindre une résolution flirtant avec les 10 à 20 nanomètres ! Malheureusement, le système d'acquisition des images, point par point, demande beaucoup de temps et ne permet pas d'observer une dynamique. De plus, comme la majorité des microscopes optiques, la lumière émise par le microscope sur l'échantillon est nocive pour les cellules vivantes et affaiblit la fluorescence des marqueurs biologiques, ce qui nuit à la qualité et à la durée des observations.

C'est dans ce contexte problématique qu'est née une nouvelle forme de microscopie, aux multiples avantages, créée par les scientifiques du Howard Hughes Medical Institute à Chevy Chase aux États-Unis. Elle permet d'observer l'intérieur des cellules en mouvement, en trois dimensions, et ce sans endommager les tissus ! Explications.

Améliorer la netteté

La première stratégie est d'illuminer l'objet à observer non pas par le dessus, mais par le côté. Ceci est réalisable à l'aide de deux objectifs (d'illumination et de détection), situés perpendiculairement l'un par rapport à l'autre. La lumière en provenance de l'objectif d'illumination n'arrive pas directement dans l'objectif de détection, qui ne reçoit alors que la lumière déviée. Ainsi, seul le plan focal de l'échantillon que l'on souhaite observer est illuminé. Le reste de l'objet ne souffre donc pas inutilement de la lumière, et de plus on gagne en netteté.

Les cellules peuvent être observées en temps réel et en 3D ! © Thomas A. Planchon et al., Nature Methods

Mais si cette technique est déjà utilisée pour observer de gros échantillons, le faisceau lumineux est en général trop large pour s'adapter aux quelques microns d'épaisseur d'une cellule. Pour affiner le diamètre du rayon lumineux, les scientifiques ont pensé à utiliser un faisceau de Bessel (utilisé dans la détection des codes barres) qui ne diffracte théoriquement pas, mais qui comporte aussi son lot de problèmes.

Il existe notamment un cercle plus large autour du rayon principal, qui diminue la netteté de l'image. Pour l'éliminer, les physiciens ont modifié deux paramètres. Tout d'abord, au lieu d'illuminer continuellement l'échantillon, ils ont fait en sorte d'allumer et d'éteindre le faisceau sans cesse, de façon très rapide. De plus, ils ont utilisé ce que l'on appelle la microscopie biphotonique, où les photons émis possèdent la moitié de l'énergie nécessaire à l'excitation des molécules. Ainsi, seule la zone où le rayon lumineux est le plus focalisé est excitée, ce qui préserve les autres plans focaux.

Accélérer l’acquisition des images

Les problèmes éliminés, il n'y avait plus qu'à balayer l'échantillon pour réaliser l'acquisition d'un maximum d'images le plus rapidement possible. Ainsi, 200 images sont obtenues par seconde, sur autant de plans focaux, suffisamment pour obtenir une reconstruction tridimensionnelle de l'échantillon à raison d'une toutes les 1 à 10 secondes.

Comme ils l'avaient espéré, les chercheurs peuvent obtenir des centaines d'images 3D sans endommager la cellule, permettant d'observer sans problème de longs processus cellulaires comme la mitose (pour voir les vidéos, visitez le site du HHMI). « Il n'existe pas d'autre technique qui permette une imagerie aussi longue, avec des détails spatiotemporels aussi nets », explique Eric Betzig, l'un des auteurs de l'article paru dans Nature Methods. Pour aller encore plus loin, ils vont maintenant tenter d'adapter la technique aux microscopes de super-résolution...

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