La technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet de mesurer la capacité d'une moléculemolécule à se déplacer au cours du temps. C'est une technique de plus en plus répandue pour étudier les mouvementsmouvements des protéinesprotéines in vivo.

Dans un premier temps, un marqueur fluorescent est couplé à la molécule d'intérêt. Ensuite, en illuminant fortement avec un laserlaser une région donnée, ces protéines sont « éteintes » définitivement c'est-à-dire que leur marqueur fluorescent ne peut plus émettre de lumièrelumière. Le retour progressif de la fluorescence dans ce « trou noirtrou noir » n'a lieu que si les protéines sont en mouvement, ce qui permet de mesurer leur mobilité. Le principe de la microscopie à deux photonsphotons est d`exciter une molécule fluorescente par un faisceau infrarougeinfrarouge produisant des impulsions ultra-brèves tellement intenses que deux photons sont absorbés simultanément par cette molécule.

Pour des raisons physiquesphysiques, ce type d`excitation à deux photons n`a lieu qu`au point focal, dans un volumevolume de quelques micronsmicrons, et tout se passe comme si la lumière d`excitation était créée dans ce volume uniquement. Les images sont obtenues en déplaçant ce volume par balayage du faisceau laser. Le confinement de l`excitation et la meilleure pénétration du la lumière infrarouge permet une imagerie en profondeur beaucoup plus fine et limite les effets photo-destructeurs de l`imagerie classique à un photon. En couplant ces deux techniques, il est alors possible de suivre les déplacements d'une protéine en trois dimensions dans une cellule.

L'avenir de la microscopie à deux photons

Au niveau de la recherche en biologie, le développement de la microscopie à 2 photons devrait permettre la transposition in vivoin vivo d'études aujourd'hui uniquement possibles sur des échantillons fixés.

Parallèlement, les perspectives médicales de cette microscopie se profilent déjà. Par rapport à toutes les méthodes d`imagerie optique conventionnelle, la microscopie à 2 photons offre des avantages uniques : son rayonnement est moins destructeur et pénètre plus profondément dans les tissus ; mais surtout elle permet de réaliser une image nette et directe d`une lésion située en profondeur comme si elle était à la surface de l`échantillon.

Ce diagnosticdiagnostic optique de pointe est maintenant expérimenté par l'équipe de François Amblard en collaboration avec le Service d'Anatomopathologie de l'Institut Curie. Les premières images obtenues donnent des informations sur la structure des tissus jusqu'à l'échelle subcellulaire, mais aussi sur leur métabolismemétabolisme. Avec la microscopie à 2 photons, le diagnostic pourrait, dans un proche avenir, être instantané et ne nécessiterait aucune préparation ni biopsiebiopsie.

La microscopie à 2 photons offre des avantages uniques : son rayonnement est moins destructeur et pénètre plus profondément dans les tissus.

La microscopie à 2 photons offre des avantages uniques : son rayonnement est moins destructeur et pénètre plus profondément dans les tissus.