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Microscope en fluorescence

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Le microscope en fluorescence fait partie de la grande famille des microscopes optiques.

Technique du microscope en fluorescence

La fluorescence est la propriété que certains corps ou molécules ont à émettre une lumière après avoir été excités avec une lumière d’énergie supérieure.  Ainsi, un objet excité par une longueur d’onde émettra une fluorescence à une longueur d’onde supérieure. 

La technique du microscope en fluorescence est donc la même qu’un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n’est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d’onde. Toutefois, en général, la lumière arrive sur l’échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous.

À l’émission, on peut alors utiliser des lasers possédant une longueur d’onde unique ou des filtres d’excitation ne laissant passer que la lumière de longueur d’onde désirée sur l’échantillon.  Après excitation de l’échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière d’une longueur d’onde différente. On peut utiliser des filtres permettant de n’observer que la longueur d’onde désirée, c'est-à-dire les photons d’émission, et bloquer les photons d’excitation.

Utilisation du microscope en fluorescence

Le microscope en fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents (chlorophylle...), ou des molécules rendues fluorescentes pour mieux les observer (protéines couplées à la GFP, DAPI pour l’ADN, fluorochromes…).

Des techniques utilisant cette microscopie ont été développées :

  • immunofluorescence (marquage à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome) ;
  • FISH ou hybridation fluorescente in situ pour marquer des séquences nucléotidiques grâce à des oligonucléotides couplés à des fluorochromes ;
  • FRET ou transfert d'énergie entre molécules fluorescentes permet de visualiser si deux molécules interagissent ;
  • BIFC ou complémentation de fluorescence bimoléculaire permet de visualiser une interaction en reconstituant l'intégrité d'un fluorochrome à l'aide de deux molécules...

Une mitose est observée au microscope à épifluorescence grâce à différents fluorochromes (l'ADN en bleu, la tubuline en rouge et une protéine centromérique en vert). © F. Lamiot, CC by-sa 3.0 Une mitose est observée au microscope à épifluorescence grâce à différents fluorochromes (l'ADN en bleu, la tubuline en rouge et une protéine centromérique en vert). © F. Lamiot, CC by-sa 3.0

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