Clonage... à qui le tour ? - 08/05/2007

Un dossier réalisé par Jean-Paul Renard, responsable de l'Unité de Biologie du Développement et Biotechnologie de l'Inra.

© Inra

La nouvelle du premier clonage de mammifère nous avait tous profondément ébranlés. Lorsque nous en avons pris connaissance par l'intermédiaire de la presse, l'information nous avait d'abord fait l'effet d'une bombe. D'épouvantables fantasmes jusqu'alors tapis derrière « le mur de l'impossible », commencèrent à prendre forme au cœur de la réalité. Des fantasmes qui jusqu'ici ne s'étaient exprimés que par l'intermédiaire de quelques auteurs de science fiction. Nous avions l'impression, tout à coup, de devenir les acteurs d'un inquiétant scénario qui allait peut-être prendre forme dans notre vie quotidienne.

Cloner en biologie signifie : produire un ensemble d'objets ou d'organismes de même constitution génétique que celle d'un objet ou d'un organisme déjà existant. On peut cloner des molécules d'ADN, des cellules, ou aussi des embryons en les coupant en deux (jumeaux) ; dans le cas d'organismes complexes comme une grenouille ou un mammifère, il faut d'abord disposer d'ovules dont on enlève le noyau pour le remplacer ensuite par le noyau d'une cellule prélevée sur l'organisme adulte, par exemple une cellule de peau ou de muscle.

Clonage femelle

Le clonage est une technique qui permet, par exemple, d'obtenir des animaux sans passer par la reproduction sexuée c'est à dire sans la rencontre de deux gamètes. Autrement dit le clonage est une reproduction asexuée.

Avant de vous donner la recette du clonage d'un animal, je voudrais vous signaler que le fait de « cloner », c'est à dire obtenir des organismes ou des entités possédant le même ensemble de gènes n'est pas quelque chose d'exceptionnel. On peut procéder de façons très différentes. Ainsi :

• une cellule mise isolément en culture et qui, en se divisant plusieurs fois, donne naissance à plusieurs cellules, forme un clone cellulaire

• une molécule d'ADN insérée dans un plasmide que l'on multiplie ensuite dans une bactérie selon des techniques mises en place dans le courant du XXème siècle, donnera un clone moléculaire

• la dissociation des cellules d'un embryon au tout au début de son développement après seulement 2 ou 3 fois divisions de l'œuf fécondé, alors qu'il n'est formé que de quatre à huit cellules permet d'obtenir à partir de chacune d'elle un embryon. Si nous les implantons ensuite dans une femelle porteuse, ils pourront donner plusieurs jeunes qui possèderons chacun le même ensemble de gènes puisqu'ils proviendront du même embryon

• enfin, la scission en deux parties à peu près égales, à l'aide d'un micro scalpel, d'un embryon un tout petit peu plus vieux prélevé au moment où commencent à se réaliser les premières différenciations cellulaires permet très facilement de fabriquer des jumeaux

Un animal cloné ou « clone » est un animal issu du transfert du noyau d'une cellule (extraite d'un individu dont on veut obtenir la copie) dans un ovule énucléé (extrait d'une femelle) c'est à dire dont on a enlevé le noyau.

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On peut obtenir des clones, avec le même génome, de plusieurs manières différentes.

• Qu'est-ce qu'un ovule ?

Tout animal provient du développement d'une cellule initiale, que l'on appelle l'œuf fécondé ou zygote. Cette cellule initiale est le produit de la fusion de deux cellules appelées « gamètes » :

*un gamète d'origine paternelle : le spermatozoïde (formé dans les testicules du mâle).

* un gamète d'origine maternelle : l'ovule (formé dans les ovaires de la femelle).

• Qu'est-ce qu'un plasmide ?

Il y a plus de vingt ans, on a découvert que des morceaux d'ADN en forme d'anneaux peuvent se perpétuer au sein de bactéries. On les appelle « plasmides ». A la différence des virus, ils ne peuvent pas sortir de la cellule pour vivre une vie autonome.

Autrement dit, un plasmide est une sorte de virus qui ne peut vivre qu'à l'intérieur d'une bactérie ou d'une cellule comme un morceau d'ADN indépendant. Il se multiplie au fur et à mesure que la cellule ou la bactérie se multiplie. Les généticiens utilisent les plasmides comme un outil capable de multiplier à volonté (ou cloner) des morceaux d'ADN.

• Avec la méthode des jumeaux, à quel moment de l'évolution de l'embryon doit-on couper la cellule ?
  

A sept jours ! C'est un moment très important dans l'histoire du développement de l'embryon, car c'est à ce moment là que commencent à se différencier les premières cellules.

La dernière technique est celle du transfert de noyaux utilisée pour obtenir Dolly. Aujourd'hui, lorsque nous parlons de clones, nous parlons le plus souvent d'animaux issus de cette technique. Son principal avantage, c'est qu'elle permet de partir non pas de quelques, mais de milliers de cellules en culture. C'est avec la naissance de Dolly que le mot clone a commencé à désigner presque exclusivement un animal issu du transfert de noyau de cellules déjà différenciées. Mais pour vous dire la vérité, cette association devenue systématique entre transfert de noyaux et clonage nous pose quelques problèmes à nous les scientifiques !

Clonage mâle

• Pourquoi ?

Parce qu'on peut très bien utiliser le transfert de noyau pour autre chose que pour produire des clones. On peut introduire un noyau dans un ovule énucléé pour comprendre les relations entre le noyau et le cytoplasme, par exemple. On peut aussi utiliser cette technique pour produire à partir de noyaux de cellules différenciées des cellules embryonnaires qui pourraient rendre de grands services à la médecine : étant capables de se différencier en de nombreux types cellulaires, ces cellules pourraient permettre de produire en culture une très grande variété de tissus qui pourraient après greffe chez un receveur remplacer des tissus différents : c'est ce que l'on appelle le « clonage thérapeutique » par opposition au « clonage reproductif » .

• Le principe de base.

Dans un organisme animal il existe une cinquantaine de cellules différentes. Jusqu'ici nous savons faire des clones de mammifères avec 6 ou 7 types cellulaires différents :

a)des cellules de la peau, mais très faciles à obtenir, par exemple en prélevant un peu de tissu à l'oreille par une technique proche de celle utilisée pour le « piercing »

b)des cellules musculaires

c)des cellules qui entourent l'ovule, appelées « cellules de cumulus »

d) et même des cellules provenant des lymphocytes du sang.ou des cellules nerveuses.

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Pour l'instant nous ne savons pas encore si nous pouvons faire des clones avec toutes les cellules. Le fait d'avoir réussi à obtenir des petites souris, même si cela a été avec beaucoup de difficultés à partir de cellules apparemment complètement diiférenciées comme les cellules nerveuses montre que l'éventail de possibilités pour recréer un embryon est assez large. Par conséquent, il est vraisemblable, que d'autres types cellulaires pourront être utilisés pour cloner. Par exemple, au Japon, des chercheurs ont réussi à faire un clone de vache à partir de cellules contenues dans le lait, des cellules mammaires ! Dans ce cas il suffit de prendre une goutte de lait et d'en extraire les quelques cellules mammaires qu'elle contient.

Ce dernier exemple nous montre qu'un grand nombre de types cellulaires peut donc contribuer à retrouver l'état de cellules embryonnaires.

• Première étape : Isoler des cellules de lapin adulte.

On prélève des cellules qui entourent les ovules (les cellules du cumulus), cellules qui sont différenciées et faciles à isoler lorsqu'on récupère des ovules sur une femelle adulte.

• Mettre ces cellules en culture, c'est à dire les placer dans une boîte appelée boîte de pétri, couramment utilisée en culture cellulaire avec du milieu nutritif à 38° C de façon à ce qu'elles puissent survivre et même se multiplier en attendant d'être prélevées comme source de noyaux. Très vite, des milliers de cellules tapissent le fond de la boîte. On peut continuer à les multiplier en renouvelant le milieu de culture et en répartissant les cellules dans plusieurs boîtes. On peut aussi, si on le souhaite, congeler les cellules pour les décongeler plus tard selon les besoins.

• Quand on a décidé de les utiliser, il faut les traiter avec une enzyme de façon à les dissocier les unes des autres en cassant les liens qui les retiennent entre elles pour avoir à disposition quelques centaines de cellules

• Deuxième étape : Accéder à des ovules

Prendre des ovules de lapine : Se procurer ces cellules très précieuses que sont les ovules d'une lapine et les mettre en culture, pour maturation, durant 24 heures.

• Troisième étape :

Vider les ovules de leur noyau (les énucléer) : Prendre les ovules et les placer sous un microscope de façon à enlever leur noyau, à l'aide de micro-instruments en verre, fabriqués spécialement à cet effet.

• Quatrième étape : transférer le noyau

• La méthode la plus simple consiste à faire en sorte que l'ovule et une cellule cultivée (dix fois plus petite environ que l'ovule) fusionnent entre eux. Il suffit pour cela de les placer côte à côte et d'induire un petit champ électrique très bref. Les membranes fusionnent entre elles permettant au noyau d'entrer dans l'ovule.

• Il y a une autre méthode qui consiste, non pas à faire en sorte que la cellule fusionne avec l'ovule mais à percer la membrane de l'ovule à l'aide de la micropipette afin d'y introduire directement le noyau. Mais cette méthode n'est possible que lorsque le noyau se trouve à un stade particulier du cycle cellulaire.

Quelqu'un de bien entraîné peut reconstituer environ une vingtaine d'embryons en une heure.

• Cinquième étape : Cultiver l'embryon reconstitué

Une fois la cellule œuf ainsi reconstituée, la remettre dans l'étuve dans un milieu de culture particulier, Si tout s'est bien passé, elle commencera à se diviser en deux cellules dès le lendemain comme le fait un embryon issu de fécondation, avec un peu de retard toutefois.

• Sixième étape : Transplanter

La transplantation dans une femelle porteuse peut être effectuée dans les heures qui suivent la reconstitution de la cellule œuf. Mais il vaut mieux attendre quelques jours pour ne transplanter que les embryons qui auront commencé à se développer. Chez certaines espèces, comme la vache il vaut mieux attendre une semaine, c'est à dire ne transplanter que les embryons pour lesquels les cellules commencent à se différencier : c'est le stade blastocyste. En effet, à ce stade, on peut transplanter l'embryon par les voies naturelles dans l'utérus d'une femelle porteuse

• Septième étape : la mise au monde

L'embryon de lapin va ainsi passer environ 30 jours dans l'utérus de la mère porteuse. Et si tout se passe bien, nous aurons un petit lapin semblable à n'importe quel autre petit lapin nouveau-né !

Mais attention ! Le taux de réussite est encore très faible. Si ça ne marche pas, ne vous désespérez pas…

Le taux de réussite du clonage :
Souris : 3 % de réussite - Vache : 3 à 5% - Lapin : – de 1% - En moyenne, on arrive à un taux de 2 à 3% de réussite.

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En revanche et on ne sait pas l'expliquer, le taux de réussite peut être beaucoup plus élevé sur certaines séries expérimentales : pour les vaches, ce taux peut atteindre jusqu'à 40%. Rappelons pour mémoire, que le taux de réussite d'une fécondation « normale » chez une vache est de 55%.

Avant de juger des dangers de récupération d'une telle recherche par certains apprentis sorciers issus de sectes pour le moins bizarres ou de quelques « médecins » soit disant soucieux du bien-être de leurs patients, donnons la parole à la défense et posons la question de savoir où nous en sommes aujourd'hui dans la mise au point d'une telle technique.

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Il est certain qu'un chercheur tel que Jean-Paul Renard qui, au sein de son laboratoire, produit des clones de vaches, de souris et de lapins, peut découvrir des phénomènes biologiques importants liés au développement de l'embryon. Par exemple : en transférant le noyau d'une cellule dans un ovule, il s'est rendu compte que les évènements moléculaires qui se produisent au tout début du développement de l'embryon peuvent avoir des conséquences beaucoup plus tard dans l'histoire du développement du fœtus et même de l'individu après sa naissance. Ces recherches sont primordiales pour savoir quels sont les risques encourus par un individu cloné.

Par ailleurs, on observe chez la vache que les embryons clonés commencent à se développer apparemment normalement pendant la première semaine, avant que ne se mette en place le processus qui conduira à l'implantation de l'œuf dans l'utérus de la mère porteuse. La proportion d'embryons qui commencent ainsi à se développer est voisine de celle que l'on obtient après fécondation in vitro On a constaté qu'il en est de même chez la souris où jusqu'à 80% des embryons clonés peuvent s'implanter

Et puis, très souvent tout commence à dérailler : la formation du fœtus devient anormale et le développement s'arrête. Pour la souris, le phénomène se produit rapidement après l'implantation. Pour la vache, c'est plus tard et plus progressif. On constate l'arrêt du développement du fœtus au bout du deuxième mois pour certains, du troisième ou du quatrième pour d'autres, et même pendant le dernier trimestre de la gestation alors que ce n'est pratiquement jamais le cas dans les conditions naturelles ou après transfert d'embryons issus de fécondations in vitro. Finalement, il n'y a qu'environ 5 à 10% des embryons transplantés qui se développent à terme. Comme un tiers environ des embryons reconstitués sont transplantés, ce n'est pas beaucoup.

• A-t-on des explications à ce phénomène de « rejet » de la part de l'organisme ?

On a des explications pour le tout début du développement, lorsqu'il n'y a encore que quelques divisions cellulaires. La cause est liée aux remaniements que subit le noyau lorsqu'il arrive dans l'ovule, des erreurs qui se produisent lorsque la cellule commence à se diviser. Si le noyau transféré n'est pas parfaitement bien reconstitué, la mécanique de division de la cellule œuf s'arrête vite et les premières différenciations cellulaires n'ont pas le temps d'apparaître.

S'il n'y avait que cette raison ce serait assez simple. Ce qui est beaucoup plus troublant, c'est qu'il y a des embryons qui commencent à se développer apparemment tout à fait normalement. Chez la vache par exemple, où l'on peut suivre le développement du fœtus pendant les premiers mois de la gestation (par échographie, comme on le fait chez la femme) on voit le fœtus qui se forme et grossit, le cœur qui bat et les bourgeons des membres qui apparaissent et deviennent de petites pattes. Plus tardivement, vers six ou sept mois, et même quelquefois, juste avant la mise bas, on constate que le fœtus se met à grossir beaucoup trop vite : les « poches des eaux », formées par les structures placentaires peuvent devenir énormes, deux fois plus que la normale A tel point qu'à la naissance, le veau peut peser le double du poids normal et la vie de la vache être mise en grand danger. Il y a ainsi environ 30% des veaux qui meurent juste avant ou dans les quelques jours qui suivent la naissance.

On constate que ces veaux ont développé une ou plusieurs anomalies anatomiques ou physiologiques, de façon plus ou moins marquée selon les individus: anomalies du système cardiovasculaire, foie plus gros que la normale, reins atrophiés ou anormalement développés, langue trop grosse, rate énorme et aussi glycémie dérégulée (diabète), hypertension artérielle, poumons incapables de commencer à fonctionner, déficit immunitaire, température plus élevée que la normale (40° à 42°C au lieu de 38°C) pendant une à deux semaines. Dans ce dernier cas par exemple, on croyait au début que ces veaux souffraient d'une maladie infectieuse et qu'ils avaient de la fièvre, et on les traitait aux antibiotiques, ce qui ne servait strictement à rien.

Malgré tout, on constate qu'il y a des animaux qui peuvent naître sans présenter aucune de ces anomalies. Et avec ceux qui présentaient des anomalies et qui arrivent à passer le cap des premières semaines on s'aperçoit que tout finit par se réguler et par rentrer dans l'ordre. Ils sont alors d'apparence physiologique tout à fait normale.

• Avez-vous des pistes sur l'origine de ces déraillements ?

Pour l'instant nous accumulons les indices et nous faisons beaucoup de constats. Nous savons que l'environnement du fœtus joue un rôle très important et l'hypothèse que nous faisons est la suivante : tout se passe comme si, avec ces animaux, il y avait eu au cours de leur vie fœtale une désynchronisation entre leur état de développement et les apports nutritifs que leur fournit la mère, via le placenta. Quand on en discute avec des médecins, on réalise que les maladies ou anomalies que nous décrivons évoquent, en les exagérant, les symptômes que manifestent certaines femmes chez qui la grossesse évolue mal, parce que leur régime alimentaire pour une raison ou une autre s'est trouvé déséquilibré, trop pauvre ou trop riche, à certains moments de la vie du fœtus qu'elles portent. Ces médecins nous disent que ces perturbations de la physiologie du fœtus quand elles ne sont pas immédiatement graves disparaissent après la naissance, mais peuvent réapparaître beaucoup plus tard, au cours de la vie adulte de ces bébés. Quarante ans après leur naissance, ils seraient plus sujets que les autres à des maladies cardiovasculaires ou à certaines formes de diabète ! Ces médecins sont très intéressés par nos travaux sur l'animal, car ils pourraient permettre de comprendre beaucoup mieux l'origine fœtale de nombreuses maladies. On croyait qu'elles étaient surtout déterminées génétiquement, et il se pourrait que l'environnement embryonnaire et fœtal ait un rôle très important. Et que ce rôle s'exerce sur le fonctionnement des gènes très tôt, dès le début de la vie embryonnaire.

• Qu'est ce que ces recherches vous ont appris ?

Avec le clonage, nous réalisons encore un peu mieux que nous ne sommes pas que le produit de nos gènes ! Nous sommes aussi le résultat d'une discussion permanente entre l'ensemble des gènes (le génome) dans le noyau et leur environnement cellulaire (le cytoplasme), entre l'embryon et son environnement utérin. D'où l'intérêt de ces recherches pour comprendre l'origine de certaines maladies comme le diabète ou les maladies cardiovasculaire. Il est tout à fait possible qu'en étudiant le développement des clones, nous puissions un jour apporter beaucoup à la médecine, en terme de recommandations nutritionnelles pour les femmes enceintes par exemple.

• Est-ce que l'étude de cet environnement du noyau vous a déjà permis de découvrir des choses intéressantes ?

Et comment ! On peut dire, schématiquement, qu'avant le clonage on considérait que le noyau de cellules différenciées (comme le sont les fibroblastes de peau) ne pouvait pas retrouver un état embryonnaire. Lui faire récapituler à nouveau toutes les étapes du développement jusqu'à la naissance d'un jeune viable était considéré comme biologiquement impossible.

Ayant dû admettre, depuis la naissance du mouton Dolly, qu'un noyau de cellule différenciée (une cellule adulte) pouvait redonner un être vivant apparemment normal, des chercheurs d'autres disciplines ont observé leurs cellules en culture avec un tout autre regard. Et ils ont découvert ainsi qu'il existait dans l'organisme adulte, des cellules qui restaient à l'état indifférencié (c'est à dire un peu comme les cellules embryonnaires). On en a trouvé dans différents tissus du corps comme le cerveau, les muscles, la moelle osseuse, la peau. On s'est aperçu qu'en mettant ces cellules indifférenciées, celles du cerveau par exemple, dans un environnement de cellules musculaires, elles commençaient à se transformer en cellules musculaires. On appelle ces cellules adultes indifférenciées : « cellules souches ».

Elles nous montrent en premier lieu, que la plasticité de fonctionnement d'une cellule et de son noyau est beaucoup plus grande que ce que l'on croyait jusqu'à maintenant. La découverte de ces cellules souches dans différents tissus, comme par exemple le tissu nerveux, est une découverte fondamentale. Et c'est bien parce que le clonage vernait de démontrer que le noyau de cellules différenciées pouvait retrouver un état embryonnaire que ces recherches ont été engagées ! Un nouvel état d'esprit vis à vis de la différenciation cellulaire, et ce sont des nouvelles questions fondamentales pour la biologie qui deviennent accessibles à l'expérimentation. La réponse à ces questions ouvre aussi des perspectives nouvelles pour de nouvelles applications thérapeutiques.