Immunologie : à la recherche de l’âme sœur - 06/11/2007

Les lymphocytes T sont les acteurs majeurs de la réponse immunitaire dite adaptative. On trouvera dans ce dossier une description des processus qui leur permettent, à travers une chorégraphie complexe, d'assurer une veille permanente au sein de l’organisme et de jouer ainsi leur rôle de sentinelles en réponse aux agressions.

L’immunité dite adaptative a été lentement élaborée au cours de l’évolution, à côté de sa consoeur, l’immunité innée, d’origine beaucoup plus ancienne.

Une catégorie particulière de cellules hématopoïétiques, les lymphocytes B et T, en assure le fonctionnement. Une particularité de ces cellules repose sur leur capacité, à priori illimitée, à détecter tout ce qui est étranger à l’organisme, en général sous la forme de fragments peptidiques. Dans le cas des lymphocytes T, objet de toutes nos attentions, cette détection nécessite une « quête » perpétuelle dont le but final sera de générer une véritable armée de descendants capables de combattre l’intrus et d’en garder la mémoire. Pour que ce processus fondamental ait lieu, le lymphocyte T adopte une stratégie particulière qui l’amène à parcourir sans cesse les tissus lymphoïdes de l’organisme.

Image montrant l’interaction entre un lymphocyte T et une cellule dendritique. Dans ce cliché, le lymphocyte T, beaucoup plus petit, contient une bio-sonde fluorescente, la protéine Akt PH-GFP, marquant sa membrane plasmique.

Cette recherche n’aura de cesse tant qu’il n’aura pas détecté l’intrus qui lui sera présenté comme une offrande par les cellules dendritiques, une classe particulière de cellules phagocytaires spécialisées dans cette fonction de présentation. Une étreinte prolongée avec le lymphocyte T en résultera (voir la figure ci-dessus), dont l’aboutissement sera l’activation de ce dernier et sa multiplication par d’intenses divisions.

On trouvera dans ce dossier une description de cette chorégraphie cellulaire grâce à laquelle se met en place cette composante majeure de la réponse immunitaire.

Le système immunitaire met schématiquement en jeu deux modes de défense contre les agressions : l’immunité innée et l’immunité adaptative qui ont toutes deux pour fonction la détection de tout ce qui est en principe étranger à l’organisme (virus, bactéries, parasites, cellules cancéreuses, etc.).

S’il est difficile de donner des définitions strictes des deux systèmes, l’immunité innée se définie néanmoins classiquement par le fait que c’est un système « archaïque », très conservé au cours de l’évolution et présent dans la plupart des organismes multicellulaires, même très primitifs ; le caractère invariant et le nombre limité des récepteurs impliqués dans la reconnaissance des pathogènes, ainsi que le faible éventail de leur spécificité, en sont aussi des caractéristiques importantes. Enfin, c’est une immunité à mise en jeu immédiate. On peut donner ici en exemple la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont on connaît plus d’une dizaine de membres exprimés par de très nombreuses cellules (comme les polynucléaires, les macrophages, les cellules dendritiques, certains lymphocytes, les cellules natural killer et même certaines cellules d’origine non hématopoïétique comme les cellules épithéliales). Chacun reconnaît une ou quelques structures moléculaires bien définies, partagées par de très nombreux pathogènes, comme certaines molécules ubiquistes des membranes bactériennes. On parle souvent de PAMP (« pathogen-associated molecular pattern ») pour désigner ces molécules qui n’ont en général aucune ou une faible variabilité dans leur composition. Un des exemples les plus connus est celui du LPS, endotoxine bactérienne provenant des bactéries Gram-négatives et reconnue par le TLR4.

- Figure  : 1

Légende : Les cellules de l’immunité innée sont pour beaucoup des phagocytes naturels. Lors d’une infection, bactérienne par exemple, ces cellules vont reconnaître grâce à des récepteurs spécifiques (comme les TLR ou récepteurs « Toll-like ») les composants bactériens. Ceci provoquera leur activation conduisant entres autres à la libération de nombreuses substances solubles à activité bactéricide et inflammatoire qui viendront contrecarrer l’infection.

Les résultats de cette reconnaissance sont multiples (phagocytose, production de composés bactéricides et inflammatoires, pour ne citer qu’eux) conduisant dans le meilleur des cas à l’élimination du pathogène (figure 1). Vue sous un angle finaliste on peut donc dire que l’immunité innée est un système de « déblayage » par lequel l’organisme détruit en première intention les micro-organismes qui l’agressent. Ceci en fait une première ligne de défense absolument essentielle quand les barrières physiques naturelles de défense (peau, poumons, etc.) sont franchies.

L’absence de flexibilité du système inné, incapable de s’adapter aux changements des pathogènes et à leur multiplicité extrême, a provoqué l’apparition chez les vertébrés d’une seconde ligne de défense dont les cellules effectrices sont les lymphocytes B et les lymphocytes T (LT). En quelques mots, disons qu’il s’agit d’une réponse de mise en jeu lente mais en principe hautement spécifique, c’est à dire véritablement dédiée à la reconnaissance d’un pathogène ou plutôt de ce que l’on peut appeler une signature antigénique. Le mot antigène vient d’ailleurs de « antibody generation » pour bien souligner ce fait, initialement découvert pour les lymphocytes B producteurs d’anticorps. Cet antigène, reconnu par un récepteur spécifique à la surface du lymphocyte, est en général un peptide de quelques acides aminés, lui-même issu d’une protéine venant du pathogène. La diversité des peptides à reconnaître est immense. Le corollaire de cette diversité est la nécessité de disposer d’un répertoire de reconnaissance par ces récepteurs absolument gigantesque, puisque ce système doit être potentiellement capable de reconnaître n’importe quel antigène étranger. Ceci est généré grâce à des systèmes très complexes de remaniements de l’ADN qui code pour ces récepteurs (recombinaisons génétiquesgénétiques mutations) permettant une variabilité partielle de leur structure et modifiant ainsi à façon leur spécificité (on parle de la diversité du répertoire). Le terme d’immunité adaptative vient donc de cette capacité assez extraordinaire du système immunitaire à développer un récepteur spécifique capable de répondre en théorie à toutes les agressions grâce aux signatures antigéniques que celles-ci auront générées. L’autre caractéristique essentielle bien connue de l’immunité adaptative est la mémoire immunitaire par laquelle l’organisme garde le souvenir d’une signature antigénique antérieure qu’il aura rencontrée grâce à des populations de lymphocytes mémoires à très longue durée de vie.

Le thème général d’étude de notre équipe de recherche à l’Institut Cochin concerne les modes de fonctionnement de cette immunité adaptative. Nous nous intéressons plus particulièrement aux premières étapes qui permettent à un LT dit naïf, c'est-à-dire n’ayant encore jamais rencontré l’antigène, de basculer de l’état de repos dans lequel il se trouve avant cette confrontation, vers un état dit activé, première étape de la réponse immunitaire adaptative.

Mais évoquons d’abord deux notions essentielles sur la reconnaissance des LT qui conditionnent le sens donné à ces travaux.

- La première notion est que le peptide antigénique n’est pas reconnu seul, mais en association avec les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité à la surface des cellules dendritiques (DC), cellules phagocytaires spécialisées du système immunitaire déjà évoquées plus haut. Prenons le cas « simple »d’une infection bactérienne cutanée ; les DC résidant à cet endroit vont phagocyter la bactérie, puis utiliser une machinerie sophistiquée pour en digérer les constituants protéiques et les « apprêter » en association avec les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) avant de les exprimer à leur surface. Une coopération doit donc s’établir entre la DC, qui présente l’antigène, et le LT qui le reconnaîtra, pour que la réponse T puisse avoir lieu.

- Figure : 2

Légende : Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules de l’immunité innée dont le rôle est essentiel pour le déclenchement de la réponse immune adaptative. Ces cellules sont très abondantes en périphérie des tissus (peau, poumon, intestin, etc.) où elles exercent un rôle de veille. En l’absence d’agression, les DC sont dans un état dit immature, état dans lequel leur activité phagocytaire est très élevée. En cas d’agression, elles pourront phagocyter le pathogène et aussi être activées grâce à la panoplie de récepteurs de l’immunité innée qu’elles possèdent. Ceci va entraîner leur maturation qui s’accompagne d’une baisse importante de leur activité de phagocytose, d’une augmentation de leur capacité migratoire vers le système lymphatique et les organes lymphoïdes et d’une augmentation de l’expression de différentes molécules de surface, en particulier des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Ces dernières, associés aux peptides antigéniques provenant de la digestion des pathogènes, seront alors reconnues par le  récepteur T (TCR) des lymphocytes T (LT) dans les ganglions lymphatiques.

Il faut noter ici que les DC expriment de nombreux récepteurs de l’immunité innée, comme les TLRs, dont l’activation par les composants bactériens augmente considérablement d’une part leur capacité à présenter l’antigène aux LT et d’autre part leur mobilité (voir la figure 2 et sa légende). Nous comprendrons plus loin pourquoi ce dernier aspect est essentiel. Soulignons simplement ici que les deux types d’immunité sont donc étroitement interconnectés ; on évoque souvent le caractère « instructif » de l’immunité innée pour l’immunité adaptative.

- La seconde notion est au moins aussi fondamentale. Elle stipule qu’un LT ne peut en principe reconnaître qu’un seul peptide antigénique (on parle de clone T pour faire référence à cette sélectivité). Notons ici que ceci n’est pas tout à fait vrai dans l’absolu car il existe ce que l’on appelle une dégénérescence de cette reconnaissance qui fait qu’un LT peut s’adapter à des antigènes légèrement différents. Quoiqu’il en soit, le prix à payer pour avoir des LT couvrant cet éventail gigantesque de spécificité différente dont nous parlions plus haut, correspondant en théorie à toutes les situations d’agressions possibles, est que nous n’avons qu’un nombre infime de LT d’une spécificité donnée identique (entre 1 sur 1 million et 1 sur 10 millions !). Si la situation en restait là, pour un pathogène donné, le combat serait par trop inégal entre ces quelques LT spécifiques et l'assaillant. Pour palier ce problème, un seul remède : l’amplification clonale qui peut augmenter transitoirement cette proportion à 1 sur 1000. Comme son nom l’indique, celle-ci va amplifier par d’intenses multiplications cellulaires, le ou les clones T naïfs les mieux adaptés pour donner une armée de LT effecteurs qui vont combattre le pathogène et de LT mémoires qui garderont « le souvenir de ce combat » afin de répondre plus vite en cas de nouvelle agression du même pathogène.

Quelle chance théorique un LT a-t-il de rencontrer la signature antigénique contre laquelle il est programmé quand celle-ci se manifeste ? En vérité s’il était immobile ses chances seraient quasiment nulles. Or, on comprend facilement que ce paramètre conditionne de manière essentielle la vitesse à laquelle la réponse adaptative va se développer, ce qui est essentiel si on veut rapidement juguler le péril. Pour augmenter ces chances un LT n’a donc d’autre alternative que « de se mettre en marche ». C’est à lui de traquer « l’intrus ». Cette traque, il va la mettre en place par une course perpétuelle, course qui l’amène en particulier à parcourir ce que l’on appelle les organes lymphoïdes secondaires, constitués principalement par les ganglions lymphoïdes disséminés un peu partout dans l’organisme.

- Figure : 3

Légende : Pour entrer dans les ganglions les LT du sang circulant doivent traverser l’endothélium de vaisseaux très particuliers appelés « high endothelial veinule » (HEV). Il s’agit d’un processus hémodynamique assez complexe dans lequel les LT entraînés passivement par le flux sanguin doivent d’abord freiner leur course, se mettant à rouler à la surface des cellules endothéliales, pour finalement s’arrêter en adhérant fermement à celles-ci. Elles traversent ensuite la barrière de l’endothélium en se frayant un passage entre deux cellules pour se retrouver dans le ganglion. L’ensemble de ces phases implique différents récepteurs comme le CD62L, le CCR7 capable de reconnaître des chimiokines, substances attractives produites au sein même du ganglion, ainsi que des molécules d’adhésion (comme l’intégrine LFA-1).

Regardons un schéma général illustrant ce déplacement des LT (figure 3). L’aspect le plus important de cette figure concerne le fait que plusieurs fois par jour les LT qui sont passivement véhiculés par le sang circulant traversent activement la paroi de vaisseaux particuliers appellés HEV (pour high endothelial veinules) présents dans les ganglions. Ils passent alors dans le tissu ganglionnaire. C’est une de leurs propriétés essentielles, contrôlée par toute une série de récepteurs membranaires présents à la surface des LT et à la surface des HEV qui vont permettrent au LT de freiner sa course, puis de stopper et ensuite de traverser la barrière de l’endothélium. On a pu créer par manipulation génétique des souris qui n’expriment plus certains de ces récepteurs, comme la L-Sélectine (CD62-L) ou le CCR7. Le résultat est que ces animaux ont des déficits sévères des réponses immunitaires car leurs LT ne peuvent plus s’arrêter dans les ganglions. Le nom anglais que l’on a donné à ce processus est celui de « homing » (retour à la maison), difficile à traduire, mais que l’on peut désigner par écotaxie. On a calculé qu’un LT ne restait pas plus de 30 min par jour dans la circulation sanguine, ce qui signifie qu’il passe le plus clair de son temps dans les organes lymphoïdes.

Une fois dans le ganglion, le LT n’est plus soumis au flux sanguin. Il devra se déplacer par lui-même. Longtemps ignorée, cette propriété n’a été mise en évidence que très récemment par une série d’études employant des techniques de microscopie sophistiquées (notamment la microscopie biphotonique).

- Figure : 4 

Légende : Approche expérimentale employée pour l’étude des mouvements de lymphocytes T vivants au sein des ganglions lymphatiques.

Celle-ci permet de suivre in situ, directement dans les ganglions, le comportement des LT. L’expérience est en pratique assez simple (figure 4). Elle consiste à purifier des LT de souris, à les marquer avec une substance fluorescente, puis à les réinjecter par voie veineuse dans un animal hôte dans lequel on pourra observer leur comportement dans les ganglions. Un autre moyen plus direct développé dans notre laboratoire consiste à faire des tranches de ganglions (de quelques centaines de microns d’épaisseur) puis à déposer dessus des LT fluorescents, le tout dans des conditions de milieu, de température et d’oxygénation optimales.

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Film 1. Dans cette expérience les mouvements des lymphocytes T ont été analysés au sein d’une tranche de ganglion. Les lymphocytes T sont rendus visibles grâce à un produit fluorescent dont ils sont chargés avant l’analyse en microscopie,  effectuée ici à un assez faible grossissement (10X). On peut observer sur la droite une zone sombre dans laquelle il y a très peu de lymphocytes T. Il s’agit d’un follicule lymphoïde sous-capsulaire occupé par les lymphocytes B.

Que voit-on avec ce type d’approche expérimentale ? Que les LT se déforment en permanence et bougent fébrilement au sein du ganglion, d’une manière apparemment aléatoire et désordonnée (film 1). On peut s’amuser à calculer en rapportant ces déplacements du LT (~15µM par minute) à sa taille (~7µM), et en ramenant cela à l’échelle humaine, qu’il « marche » plus de 15 km par jour.

L’objet de cette fièvre du LT est en fait simple et à priori extrêmement finaliste : scruter le plus soigneusement possible l’ensemble de cet environnement tissulaire à la recherche de l’intrus. Le ganglion est en effet le véritable creuset de la réponse immunitaire adaptative car c’est le lieu privilégié de la rencontre entre le LT et la DC. Ces dernières ont en effet la faculté majeure de migrer des tissus où elles ont capturé les agents étrangers dans les ganglions via le système des vaisseaux lymphatiques.

- Figure : 5 - Cliquer sur l'image pour l'agrandir

Légende : Structure d'un ganglion lymphatique. Le tissu lymphoïde ganglionnaire est divisé en trois zones distinctes (B paracorticale - en mauve -, T corticale - en bleu pâle - et médullaire - en jaune-) soutenu par une charpente de cellules stromales et de fibres de collagène. Des vaisseaux lymphatiques collectent la lymphe dans les tissus périphériques et l'acheminent jusqu'au sinus sous-capsulaire. La lymphe est drainée vers le hile via les conduits formés par les cellules fibroblastiques réticulaires (FRC) et les sinus trabéculaires, qui convergent vers le sinus médullaire. Un détail du cortex est présenté à droite. Les lymphocytes B se regroupent au sein de follicules lymphoïdes sous-capsulaires. Les zones T sont parcourues par des sinus trabéculaires remplis de lymphe (en vert pâle) et par un réseau de fibres de collagène entourées de FRC, le long desquelles se déplacent les lymphocytes T (représentés en bleu). Au coeur des zones T se trouvent les HEV, entourées d'une couche concentrique de FRC délimitant un espace péri-veinulaire baigné de lymphe, en continuité avec le sinus sous-capsulaire. Des cellules dendritiques sont également présentes au sein des zones T, généralement associées au réseau de FRC. Elles peuvent être résidentes et collecter in situ les antigènes issus de l'ultra-filtrat lymphatique ou être issues des tissus périphériques comme nous l’avons vu plus haut.

Le tissu ganglionnaire n’est pas un espace « fluide » mais un tissu complexe rempli de cellules diverses, parmi lesquelles se trouvent ces DC (voir la figure 5 et sa légende) Les déplacements permanents des LT les amènent donc à « caresser » sans cesse ces dernières . Des études récentes suggèrent même que les LT seraient guidés dans ces déplacements par un réseau de « rails » correspondant à des fibres réticulaires qui forment un maillage dense dans le ganglion, maillage sur lequel se trouveraient aussi positionnées les DC.

Un aspect de notre travail est de comprendre la nature des moteurs à l’origine de ces mouvements des LT, en d’autres termes de déterminer ce qui conditionne ces déplacements. Ces mouvements ne sont pas une propriété intrinsèque des LT. En d’autres termes il n’y a pas de moteur interne, c’est à dire que le LT n’est pas une cellule qui trouverait en elle-même, en toute autonomie, les moyens de cette mobilité. Le LT est en réalité « une cellule sous influence ».

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Film 2. Un environnement riche en chimiokines peut être recréé in vitro en présence de cellules dendritiques, environnement dans lequel les lymphocytes T bougent activement. On peut en voir un exemple ici (les lymphocytes T sont identifiables par leur couleur bleue) dans lequel un lymphocyte T explore activement son voisinage et vient au contact de deux cellules dendritiques distantes dont il « scanne » la surface. Le pointillé rouge correspond au parcours du lymphocyte T, établi automatiquement avec un programme informatique approprié permettant de calculer la distance parcourue par la cellule.

Nous avons ainsi mis en évidence dans le laboratoire que les chimiokines CCL19 et CCL21, qui se fixent sur un récepteur spécifique présent à la surface des LT que nous avons déjà évoqué, le CCR7, sont en grande partie responsables de ces mouvements. Dès qu’ils sont soumis à un environnement riche en chimiokines (ceci se voit très facilement in vitro, film 2) les LT se mettent à se déplacer activement. Il apparaît en fait que ces chimiokines baignent littéralement le tissu lymphoïde. Ceci explique le comportement adopté par les LT dès l’instant où ils pénètrent dans le ganglion. Un LT peut rester ainsi plusieurs heures à explorer le même ganglion (si la rencontre avec le peptide n’a pas lieu bien sûr) avant d’en sortir, via le système lymphatique, pour regagner ensuite la circulation générale et aller scruter un autre ganglion, et ainsi de suite. C’est donc à un véritable travail de sentinelle, mais de sentinelle mobile, que se livre le LT pour protéger la citadelle que constitue notre corps.

La reconnaissance du peptide antigénique par le LT s’effectue grâce à un récepteur de surface dédié, le récepteur T (ou TCR). Cette molécule (il s’agit en fait d’une association entre plusieurs molécules distinctes, le TCR proprement dit et le complexe multimoléculaire CD3, dont on peut avoir un aperçu et une description succincte dans la figure 10) a la particularité comme nous l’avons vu d’être pour chaque clone T une clef unique qui va lui permettre de reconnaître l’antigène à la surface de la DC. Imaginons notre LT scannant fébrilement l’environnement ganglionnaire : soudain son récepteur T identifie ce qui constitue pour lui l’unique but de sa quête, le peptide antigénique. Son comportement en est alors radicalement bouleversé, en quelques minutes. Plus besoin de courir en effet, il vient de trouver sa raison d’être. Le LT « virevoltant » décrit plus haut va alors devenir un « amant » fidèle de celle qui vient de lui offrir le « cadeau antigénique ». Les deux cellules vont alors former un contact stable qui va durer plusieurs heures.

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Film 3. On peut voir dans ce petit film un lymphocyte T qui vient de reconnaître l’antigène à la surface d’une cellule dendritique. Un contact étroit entre les deux cellules se met très vite en place, contact qui va se prolonger plusieurs heures. La couleur bleue du lymphocyte T, passant au rouge, est liée à la présence dans la cellule d’un indicateur fluorescent qui permet de mesurer les variations du calcium intracellulaire. La couleur bleue correspond à des niveaux faibles de calcium, la couleur rouge indiquant au contraire des niveaux élevés. Cette augmentation du calcium est un des premiers évènements d’activation que l’on peut observer dans le lymphocyte T quelques secondes après la reconnaissance de l’antigène.

Un exemple typique montrant la formation de ce conjugué entre un LT naïf et une DC est montré dans le film 3. Le LT, plus petit, y est facilement identifiable car il a été chargé avec un composé fluorescent permettant de mesurer les niveaux de calcium dans la cellule.

-  Figure : 6 - Cliquer sur l'image pour l'agrandir

Légende : Plusieurs phases ont été rapportées pour décrire le comportement d’un LT au sein des ganglions lymphatiques quand il rencontre une DC présentant l’antigène. La phase 1 pendant laquelle le LT établit des contacts transitoires de quelques heures avec différentes DC n’a pas toujours été observée par les expérimentateurs. En résulterait un signal d’activation faible dans le LT (voir le code couleur indiqué en bas à droite). La phase 2 en revanche correspond à une phase de contact stable, très prolongée (jusqu’à 24h), qui permettra au LT d’atteindre le niveau d’activation optimale requis pour se mettre à augmenter de taille et à se diviser très activement (phase 3). Des populations de LT effecteurs et de LT mémoires, de même spécificité antigénique, en résulteront. Elles quitteront ensuite le ganglion pour migrer dans les tissus périphériques.

Ceci a également été observé in vivo dans les ganglions où différentes phases ont cependant été décrites suggérant que la reconnaissance n’entraînerait pas ipso facto un arrêt instantané du LT sur la DC (figure 6). Une phase initiale de contacts transitoires où le LT continuerait de passer d’une DC à l’autre a ainsi été observée dans certaines études, mais ceci, éventuellement lié à la nature de l’antigène, à sa quantité ainsi qu’à l’affinité du récepteur T, est très controversé
La zone d’apposition étroite entre les deux cellules forme ce que l’on appelle la synapse immunologique par référence à sa cousine connue de bien plus longue date, la synapse neuronale. Rappelons ici que le mot synapse est dérivé du grec sunapsis signifiant union, ce qui donne à ce vocable, si on s’arrête à cette définition stricte, une dimension assez floue en vérité. Il est en effet d’innombrables situations de contact cellule-cellule en physiologie, en dehors des systèmes nerveux et immunitaires, sans que l’on parle de synapse. Disons que les immunologistes ont une certaine propension à « coller aux basques » de leurs collègues neurobiologistes ! Il est vrai que des similitudes existent entre les deux systèmes qui pourraient le justifier, mais c’est un autre débat.

Quoiqu’il en soit le concept de synapse immunologique est aujourd’hui incontournable. Depuis une quinzaine d’années, un nombre considérable de travaux lui ont été dévolus. Ils sont difficiles à résumer en quelques lignes et nous y avons récemment consacré un article en français dans la revue Médecine Sciences auquel on pourra se référer. Disons brièvement qu’une des raisons d’être de ce phénomène est de mettre en place entre les deux cellules un véritable échaffaudage moléculaire autour du récepteur T après que celui-ci ait reconnu l’antigène.

Pour employer une image, le TCR est le premier boulon posé sur cet échafaudage, dans lequel d’autres types de récepteurs (comme les molécules d’adhésion LFA-1 et de co-stimulation CD28 et leurs co-récepteurs sur les DC) vont à leur tour interagir.

Ceci aura pour effet d’une part de stabiliser l’interaction, et d’autre part d’activer dans le LT une série de programmes moléculaires spécifiques, nous y reviendrons. En tout état de cause, ce qui est assez remarquable, c’est qu’il a été montré que la reconnaissance de quelques récepteurs T suffit à déclencher le processus, témoignant d’une sensibilité extrême du système. Etre très vite réactif, dès les premiers stades de l’agression, alors que la quantité d’antigènes étrangers est encore minime, est en effet un impératif.

- Figure : 7  

Légende : Lorsqu’une interaction stable est formée entre un lymphocyte T et un substitut de cellules présentant l’antigène (cellule B, bi-couche lipidique dans laquelle des complexes CMH-peptide et des molécules ICAM-1 ont été insérées) on observe que la synapse immunologique à la membrane de la cellule T présente une zone centrale enrichie en TCR, le c-SMAC pour « central-Supra Molecular Activation Cluster » et une zone périphérique riche en molécules d’adhésion LFA-1, le p-SMAC (p pour « peripheral »). Différentes hypothèses ont été avancées pour expliquer cette organisation, comme la taille des domaines extracellulaires des différents couples ligand-récepteur, ce qui conditionnerait « passivement » la taille de la fente synaptique, ~15nm au niveau du c-SMAC, et ~45nm au niveau du p-SMAC. Sur une analyse en coupe on obtient ainsi une structure en cocarde (dite en « bull eye » par nos collègues anglo-saxons).

Une des grandes controverses sur la synapse immunologique fut de savoir si au plan moléculaire elle était hautement organisée, sur la foi en particulier de travaux utilisant des synapses artificielles ou des cellules présentatrices différentes des DC. Comme cela est indiqué dans la légende de la figure 7, ces travaux montraient que la synapse immunologique était fortement structurée et organisée, en fonction notamment de la position centrale ou périphérique des différents type de récepteurs.

- Figure : 8

Légende : Image en microscopie électronique montrant que la synapse T-DC  est multifocale. Des zones d’apposition très serrées sont visibles (astérisques) ainsi que des zones d’apposition beaucoup plus lâches, montrant le caractère peu organisé dans son ensemble de la zone d’interaction, pourtant très étendue, formée par les deux cellules. L’hypothèse est que chacune de ces zones très serrées agissent comme une unité de signalisation indépendante (une « mini synapse » en quelque sorte), dont la durée de vie pourrait être transitoire, et remplacée par d’autres pendant toute la durée du contact. On aurait ainsi un système extrêmement fluctuant et dynamique, multifocal, très éloigné du modèle de synapse concentrique. © Cliché G. Raposo, Institut Curie, Paris

Nos travaux ont largement contribué à montrer que cette vision était fausse quand on utilise des DC, montrant une structure beaucoup plus fluctuante et dynamique dans laquelle le LT et la DC présentent des points d’ancrage multiples (voir la figure 8) pour maintenir un contact étroit, les deux cellules modifiant en permanence ces « mini synapses » durant leur interaction.

Quoiqu’il en soit, l’efficacité de cette interaction et sa durée sont des paramètres essentiels qui vont conditionner l’activation ultérieure du LT. Il est en effet acquis que les signaux d'activation déclenchés en aval du TCR dans le LT sont maintenus dans le temps, plusieurs heures. Ceci n’a pas encore pu être démontré in vivo, mais est en revanche manifeste in vitro. La synapse contribue très vraisemblablement à ce phénomène en favorisant un engagement accru de molécules de costimulation et le réamorçage de la reconnaissance de l'antigène via des phénomènes de recyclage du TCR. La synapse pourrait aussi favoriser la libération locale de médiateurs solubles, permettant une stimulation réciproque des deux partenaires cellulaires. La fonction première de la synapse entre LT et DC serait donc de permettre au LT d'atteindre un seuil d'activation critique pour sortir de son état initial, dit de repos.

"Quel est le rêve de toute cellule, devenir deux cellules". C’est par cette formulation célèbre que notre illustre prix nobel, Français Jacob, résumait en quelque sorte le but du vivant. Nulle cellule mieux que le LT ne répond sans doute à cet adage. Grossir et se diviser le plus vite et le plus efficacemment possible, voilà en effet son objectif quand il identifie l’intrus contre lequel il a été programmé. Rappelons-le en effet, un des buts majeurs de la réponse immune est l’amplification clonale, processus par lequel quelques « guerriers » isolés vont donner naissance à une véritable armée. Pour y parvenir le LT va faire appel à un véritable maillage interne de voies dites de signalisation faisant intervenir de nombreuses « cascades » enzymatiques et des dizaines de molécules intracellulaires.

- Figure : 9

Légende : Dans cette expérience des conjugués formés entre des LT et des DC ont été analysés 30 min après le début du contact pour leur contenu en protéines phosphorylées sur tyrosine (marquage en rouge). On observe très clairement le fort marquage dans la synapse, indiquant que la reconnaissance de l’antigène par le LT a déclenché l’activation de tyrosine kinases.

Une classe particulière d’enzymes, les tyrosine kinases, mises en œuvre après l’activation du récepteur T, et dont l’action va entraîner la phosphorylation sur tyrosine de très nombreuses protéines, est particulièrement importante dans ce processus (voir la figure 9). Un schéma brièvement commenté est montré dans la figure 10 afin que le lecteur prenne bien conscience de la complexité des processus engagés !

- Figure : 10

Légende : La reconnaissance par la cellule T de peptides associés aux molécules du CMH à la surface des DC implique le complexe moléculaire du récepteur T, constitué de l'association non covalente entre le TCR et les chaînes invariantes , , et du CD3. Ces différentes chaînes possèdent dans leur partie intracellulaire des motifs ITAM (pour « Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ») riches en tyrosine. L’évènement initiateur de la cascade signalisatrice dans la cellule T est le recrutement et l'activation de tyrosines kinases de la famille Src, Lck et/ou Fyn, associées au domaine intracytoplasmique de molécules de costimulation (CD4 et CD8 notamment). Ces kinases phosphorylent les tyrosines des motifs ITAMs du CD3, permettant le recrutement d’une autre tyrosine kinase, ZAP-70. ZAP-70 phosphoryle à son tour différents substrats dont la protéine adaptatrice LAT (linker for activation of T cell) qui joue un rôle crucial dans l'activation T en servant de site d'ancrage à de nombreux acteurs de la signalisation, dont les plus importants sont indiqués sur cette figure. On imagine aisément à la vue de ce schéma la complexité des interactions moléculaires et des processus de régulation engagés en aval de la synapse immunologique, nous empêchant de rentrer dans une description détaillée de ces phénomènes.

Les décrire de façon exhaustive n’aurait guère d’intérêt ici et déborderait largement le cadre de ce texte. Je tenterai néanmoins d’en l’illustrer un aspect sur lequel mon équipe travaille plus particulièrement et en rapport direct avec le processus d’amplification clonale : la voie de la PI3-kinase.

La PI3-kinase (son nom complet est phosphoinositide-3-kinase) en une enzyme dont l’activité est quasi-nulle dans les LT avant la reconnaissance de l’antigène. Lorsque cette reconnaissance survient, l’accumulation de phosphotyrosines entraîne alors son recrutement dans la synapse immunologique au contact de son substrat principal, un phospholipide membranaire particulier appellé PIP₂ (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate). L’action de l’enzyme consiste alors à greffer un phosphate sur le PIP₂ pour donner un nouveau composé, le PIP₃ (phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, absent des LT non activés. Celui-ci va alors agir comme un véritable « aimant », attirant à la membrane de la cellule des protéines possédant un domaine particulier, le domaine PH, dont l’affinité pour le PIP₃ est souvent élevée.

Légende : Depuis la fin des années 1990, la “green-fluorescent protein” (GFP) de la méduse Aequorea Victoria et ses nombreux dérivés sont largement employés dans les laboratoires pour marquer des protéines dans les cellules vivantes et les visualiser ainsi directement en microscopie à fluorescence. Dans la méduse elle-même, la protéine GFP est située dans des taches discrètes situées en périphérie, à la base de son ombrelle. C’est un outil qui a véritablement révolutionné nos possibilités d’étude expérimentale dans bien des domaines de la biologie.

Nous avons été les premiers à montrer ce phénomène dans des LT vivants en utilisant des techniques d’imagerie de fluorescence. L’astuce expérimentale consista à fusionner par génie génétique le domaine PH d’une de ces protéines, la protéine Akt (une enzyme à activité sérine/thréonine kinase), à une protéine fluorescente, la GFP (« pour green fluorescent protein »), issue d'une méduse (Aequorea victoria). Cette protéine chimérique fut ensuite introduite dans les LT qui furent mis en contact avec des DC présentant l’antigène.

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Film 4. Dans cette expérience des lymphocytes T exprimant la bio-sonde fluorescente AktPH-GFP ont été mis en présence de cellules présentant l’antigène. La cellule T située au centre présente d’importantes déformations et vient former un conjugué avec une cellule présentatrice. Dans le même temps, on peut observer une relocalisation très rapide et massive de la bio-sonde vers la synapse immunologique.

Nous pûmes ainsi suivre en temps réel les modifications de localisation de cette bio-sonde fluorescente AktPH-GFP déclenchées par la reconnaissance de l'antigène. On peut voir dans l'exemple qui est donné (film 4) que la fluorescence se concentre très vite, dans la synapse immunologique, dès que le contact a lieu. Ce changement de localisation est en fait le témoin indirect de l’activation de la PI3-kinase et de la production de PIP₃ qui débute dès que le LT reconnaît le peptide antigénique. Une des conséquences de cet évènement métabolique sera en aval l’activation d’Akt qui entraînera à son tour, en cascade, une véritable réaction en chaîne dans la cellule.

En quoi cette voie de la PI3-kinase est-elle particulièrement importante pour l’amplification clonale ? Il faut introduire ici une notion importante, à savoir que l’état de repos d’une cellule n’est pas un état inactif. Il est en effet maintenu par la mise en œuvre de différents mécanismes moléculaires qui bloquent la cellule dans cette état, l’empêchant en particulier de se mette en cycle, le mot cycle (on parle en général de cycle cellulaire) désignant l’ensemble des étapes que doit franchir une cellule pour se diviser. Pour s’y engager un des moyens utilisés par la cellule est donc de lever ces freins permanents. Il s’agit de mécanismes absolument fondamentaux à l’œuvre dans beaucoup de types cellulaires et dont tout dérèglement peut avoir des conséquences dramatiques, puisqu’il conduit souvent à une prolifération anormale des cellules, synonyme de cancer.

La voie de la PI3-kinase contrôle l’un de ces freins représenté par les molécules de la famille FOXO (pour "forkhead box O protein"), et nos travaux ont permis de montrer que ces processus étaient effectivement impliqués dans la prolifération des LT déclenchée par la reconnaissance de l’antigène.

- Figure : 11

Légende : Les facteurs FOXO, majoritairement nucléaires dans les cellules au repos, sont des cibles de la kinase Akt qui les phosphoryle sur trois positions consensus (Thr14, Ser256 et Ser319 pour FOXO1). Cette phosphorylation permet l'association de FOXO avec la protéine 14-3-3 et sa prise en charge par une machinerie d’export nucléaire impliquant en particulier les protéines Ran et Crm1. Les FOXO, ainsi exclus du noyau, ne peuvent plus alors exercer leur activité transcriptionnelle. Ceci aura pour conséquences d’entraîner une baisse de production des ARN messagers codant pour différentes protéines dont l’accumulation dans les cellules au repos bloque le cycle cellulaire (comme p27) ou favorise la mort cellulaire (comme Bim). Il est important de noter que la mutation des trois résidus cibles d'Akt en alanines inhibe l'export nucléaire des FOXO. Ces mutants constitutivement actifs ont été largement utilisés pour étudier les rôles fonctionnels de ces facteurs de transcription.

On peut tenter d’expliquer ce processus de manière assez simple (figure 11). Dans la cellule au repos, les FOXO sont dans le noyau où ils favorisent la régulation transcriptionnelle de nombreux gènes, parmi lesquels on trouve des gènes codant pour de puissants inhibiteurs de la division cellulaire, comme la protéine p27. Ceci signifie qu’à l’état de repos de la cellule les FOXO sont actifs, cette activité ayant pour but de maintenir ces inhibiteurs à de hauts niveaux d’expression. Que se passe-t-il maintenant quand le LT est activé ? Une des conséquences en sera, nous l’avons-vu, l’activation de la PI3-kinase et plus en aval d’Akt. Or les FOXO sont des cibles privilégiées de cette dernière, ce qui entraînera leur phosphorylation par Akt.

- Figure : 12

Légende : Images montrant la localisation de FOXO1, un des membres de la famille FOXO dans des LT naïfs non stimulées ou après leur interaction avec une DC présentant l’antigène. On voit clairement que la stimulation par l’antigène entraîne un changement majeur de cette localisation d’une position centrale, correspondant au noyau, vers la périphérie, correspondant au cytoplasme de la cellule.

Par des mécanismes complexes ceci provoquera l’exclusion des FOXO du noyau (voir la figure 12) et leur inactivation. Une baisse des niveaux d’expression des régulateurs négatifs du cycle cellulaire en résultera, conduisant à favoriser le démarrage de celui-ci.

Bien entendu beaucoup d’autres processus distincts et n’ayant rien à voir avec la voie de la PI3-kinase et les FOXO doivent être mis en jeu parallèlement. C’est vrai pour le LT comme pour la plupart des types cellulaires, soumis à des facteurs de croissance par exemple. Il n’en reste pas moins vrai que cette voie est cruciale. La preuve en est que beaucoup de cancers humains sont liés à des mutations « activatrices » de la PI3-kinase ou à des accumulations anormales de PIP₃ (par défaut de sa dégradation). Dans la plupart de ces cancers les FOXO sont donc inactivés ; mais il suffit de rétablir cette activité en introduisant dans les cellules tumorales des formes constitutivement actives de ces molécules (c’est à dire devenues insensibles à l’effet inhibiteur de la voie de la PI3-kinase) pour observer un arrêt spectaculaire de leur multiplication, puis leur mort. Ces différentes molécules (PI3-kinase, Akt, FOXO, etc.) sont donc aujourd’hui des cibles très prometteuses en chimiothérapie anticancéreuse, au coeur de très nombreuses recherches pour identifier de petites molécules synthétiques qui seraient capables d’en modifier l’activité.

Je tiens à remercier ici mes collègues Stéphanie Fabre, Julie Harriague, François Asperti-Boursin, Emmanuel Donnadieu et Alain Trautmann pour certaines illustrations ou expériences présentées dans ce dossier, ainsi que tous les membres de mon équipe de recherche. Je remercie Geneviève Buyssens pour sa relecture attentive de ce texte.

Pour en savoir plus on pourra se référer à deux revues récentes en langue française que nous avons publiées sur ces sujets dans la revue Médecine Sciences :

- PI3-kinase: Linking immunological synapse to T-cell proliferation

- The immunological synapse: models facing facts